芽孢桿菌發酵效果與適宜溫度和ph值

益生菌具有促進動物生長、提高機體免疫能力等生理功能，常用作微生態飼料添加劑。菌體SFU-9是一株蠟狀芽孢桿菌，該菌株在不利環境下能夠以孢子形式存在，具有耐高溫、耐酸堿和耐擠壓等優點，較乳酸菌、酵母菌等益生菌更能保持活菌狀態，適合飼料加丁業的需要。

該研究以菌株SFU-9進行實驗，研究發酵溫度、接種量、培養基初始pH值、溶解氧等因素對菌株生長的影響，確定出最佳培養條件為：培養基初始pH值為6.0~6.5，接種量5%(相對搖瓶裝液量)，培養溫度30-32℃，裝液量28 ~33mL/250mL 。發酵液中的活菌數可達10的11次方cfu/mL。在此基礎上，采用單因子和正交試驗相結合的方法，確定出最佳發酵培養基組成為：玉米淀粉2.0%，啤酒酵母1.5%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%，玉米漿2.0%。以最佳培養基配方給菌體提供營養，在最佳培養條件下培養，可以使發酵液中的活菌數高達10的12次方cfu/mL。

由于抗生素等藥物性飼料添加劑產生的藥物殘留、細菌耐藥性等危害，人們將目光投向了無毒、無公害的微生態飼料添加劑的研究和開發。我國農業部1994年公布的能夠用于生產微生態制劑的菌種有：乳酸桿菌、芽孢桿菌、糞鏈球菌、酵母菌和雙歧桿菌。

芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿和耐擠壓等優點，適合飼料加工業的需要，能夠保持較高的活菌數。孢子進入腸道后，能夠在腸道上部迅速復活而發揮生理生化作用，促進動物生長，提高機體免疫能力，該菌在飼料工業中的應用具有遠大前景。所以，本實驗選用了生產效率高、生產周期短的高密度深層液體發酵法培養菌株SFU-9，在搖床培養的條件下確定了適合蠟狀芽孢桿菌SFU-9生長的最佳生長參數，在確定的最佳生長參數的基礎上進行培養基優化的研究，使發酵液的活菌含量進一步提高達到10的12次方cfu/mL，為該菌的工業化生產提供了理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

SFU-9 菌株,本實驗室提供。

1.2 培養基

1.2.1 斜面菌種培養基(W/V)(pH=7.0)

蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏 1.0%，NaH2PO40.2%,Na2HPO40.2%，瓊脂 2.0%；

1.2.2 液體菌種培養基(W/V)(pH=7.0)

蔗糖 3.0%、蛋白胨0.5%、酵母膏 1.0%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%；

1.2.3 搖瓶發酵培養基(W/V)(pH=7.0)

基本培養基:蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏 1.0%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%；

1.2.4 活菌計數培養基(w/V)(pH=7.0)

蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏1.0%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%，瓊脂 2.0%；

1.3 培養條件

斜面菌種培養:30℃，恒溫培養箱培養24h。

液體菌種培養：用Φ1mm的接種環取3環斜面菌種于液體培養基中，裝液量30mL /250mL三角瓶，八層紗布封口，八層紗布封口,30~31℃，160r/min搖床培養16~18h，鏡檢菌體形態正常上無雜菌后備用。

搖床發酵：基本條件：裝液量30mL/250mL三角瓶，接種量2%(瓶裝液量)，八層紗布封口30℃，160r/min，培養時間16~18h。

活菌計數:30℃，恒溫培養箱培養24h。

1.4 分析方法

pH值的測定：pH S-25型pH測定儀。

生物量測定：血球計數法和平板涂布法活菌計數。

2 結果與討論

2.1 菌株SFU-9生長曲線

采用血球計數方法在發酵過程中每隔3h取一次樣，直至33h時止。做出菌株的生長曲線如圖1所示。

從圖1可以看出，當培養時間達到15~18h左右時，菌種生長基本處于穩定期。

在20 ~25h時，有芽孢形成并大量產生孢子。該實驗以菌體為目的產物，又因孢子具有耐高溫、耐擠壓和耐酸堿等性能，能夠長時期保持活力，故從圖中可知，該菌株的種齡為16~18h，發酵時間為21~24h。

2.2 培養溫度

溫度的高低與發酵中的酶反應速率、氧在培養液中的溶解度和傳遞速率等密切相關，從而影響菌體生長和產物合成。

本實驗是在基本培養條件下，將培養溫度由30℃改為分別在20，25，30，35，40，45℃下培養，采用活菌計數的方法測定發酵液中的活菌含量。菌株SFU-9的生長與溫度的關系如圖2示

從圖2可以看出，該菌株的最佳生長溫度是30~32℃。

2.3 發酵液初始pH值

在基本培養基的組成不變的前提下，將培養基的初始pH值由7.0分別調為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，然后接種培養。采用活菌計數方法測定發酵液中的活菌含量。pH值對菌株SFU-9的影響如圖3示。

由此可知，當培養基的初始pH值為5.5~6.8時，發酵液中活菌含量超過10的11次方cfu/ml，該菌最適生長pH為6.0~6.5。

2.4 接種量

在基本培養條件前提下，改變接種量，使接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，采用活菌計數方法測定發酵液中生物量。

接種量與發酵液中活菌總數的關系如圖4所示：結果表明當接種量為5%時，發酵液中的活菌總數最大，可達10的11次方cfu/mL。該研究的目的是取得最大菌體數，所以最佳接種量為5%

2.5 呼吸代謝對生長的影響

溶解氧是需氧菌發酵的必備條件，搖瓶裝液量的多少直接影響氧的傳遞。本實驗在基本培養條件前提下，改變裝液量，使裝液量分別為:15,20,25,30,35,40,45,50,55,60mL,然后接種培養。同樣采用活菌計數方法測定發酵液中的活菌含量。菌株SFU-9對氧氣的需求情況如圖5所示。

從圖中可知，裝液量為28 ~ 33mL/250 mL時，發酵液中的活菌含量最高。

2.6培養基優化

2.6.1 碳源的優化

將基礎培養基的碳源蔗糖3%分別用表1中的碳源代替，制成培養基后接種培養，用活菌計數方法測定發酵液中的活菌含量，結果見表1：

從表中可以看出，最適合蠟狀芽孢桿菌SFU-9 生長的碳源是玉米淀粉，其次為土豆淀粉和可溶性淀粉。

2.6.2 氮源的優化

將基礎培養基中的蛋白胨和酵母膏用表2中的物質替代配制培養基，用于發酵生產菌株SFU-9。

從表2可以得知有機氮源較無機氮源更有利于蠟狀芽桿菌SFU-9的生長其中以啤酒酵母為最佳，豆粕粉、酵母膏效果次之。

2.6.3 無機鹽的優化

將基礎培養基中的NaH2PO4，Na2HPO4用表3中的無機鹽代替配制培養基，研究無機鹽對菌株SFU-9生長的影響，用活菌計數方法測定發酵液的活菌含量。

由此可知，無機元素磷是蠟狀芽孢桿菌SFU-9生長所必需的元素，磷在菌體的核酸代謝、能量的貯存與傳遞方面起著重要的作用。同時，磷酸鹽也是重要的緩沖劑。

2.6.4 生長因子的影響

玉米漿富含生長因子，本實驗是在基礎培養基的基礎上添加玉米漿，研究其對菌株SFU-9的生長促進作用。

從圖6可知，玉米漿對菌株的生長有促進作用，添加量以2~2.5%為最佳。

2.6.5 正交實驗

培養基中各組分之間有一定的內在關系，為尋找它們之間最恰當的配比，在研究了碳源、氮源、無機鹽和生長因子等單因子對菌株SFU-9生長的影響以后，采用正交實驗的方法研究這些因素對菌株生長的綜合作用，以進一步完善培養基中各組分的功能，提高發酵液的生物量。

以啤酒酵母、玉米淀粉、NaH2PO4+Na2HPO4和玉米漿作為發酵因素，每個因素各選取三個水平，并按L9(3的四次方)正交表設計9組搖瓶發酵實驗，每組做兩個平行。正交實驗的因素與水平和實驗結果分析見表 4。

由極差可知，C的極差最大，D的極差最小。極差越大，反映該因素水平變動時，總指標變化越大。也就是該指標對綜合指標的影響越大。因此，按極差大小順序排列出因素的主要順序為C>A>B>D，據表4可知，菌株SFU-9最佳培養基配方為A2B2C2D2。

3 結論

由實驗可知，培養基的初始pH值、接種量，培養溫度、培養時溶氧情況的培養條件和培養基的組成對菌株的生長有很大的影響。

適合蠟狀芽孢桿菌SFU-9菌株生長的最佳條件是:

培養基初始pH值為6.0~6.5，接種量5%(相對搖瓶裝液量)，培養溫度30~32℃，裝液量28-33ml/250mL。

通過單因子分析和正交實驗，確定出蠟狀芽抱桿菌SFU-9的最優化培養基組成為：玉米淀粉2.0%，啤酒酵母1.5%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%，玉米漿2.0%。

(作者：不詳)

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