姜黃素聯合乙二胺四乙酸對熒光假單胞菌的光動力滅活作用

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）屬于假單胞菌屬，廣泛分布于自然界中，在4 ℃條件下能快速生長繁殖，是果蔬、乳、肉等食品中一種常見的嗜冷性腐敗菌。它能夠產生極耐熱的蛋白酶和脂肪酶，這些酶即使在高溫下也難以滅活，在食品貯藏過程中嚴重影響食品的風味、口感、組織狀態等，并能在食品、食品加工設備及包裝材料等表面形成生物膜，對食品持續進行污染，嚴重危害食品質量與安全。

河北科技大學食品與生物學院的王 洋、趙瑜玲、韓俊華*等探究以姜黃素為光敏劑的PDI技術對果蔬、乳品及肉品中的優勢嗜冷菌——熒光假單胞菌的滅活效果；分析乙二胺四乙酸（EDTA）對姜黃素介導PDI的協同增效作用；采用自行研制的小型光動力設備進行新鮮豬肉的PDI處理，初步分析自制設備的保鮮效果，從而為姜黃素介導的PDI在食品領域中的應用提供理論參考和技術支持。

1、PDI對熒光假單胞菌的滅活作用

姜黃素濃度對PDI作用的影響

姜黃素濃度對熒光假單胞菌的PDI作用的影響如圖1所示。隨著姜黃素濃度的增加，熒光假單胞菌的菌落數明顯降低。當姜黃素濃度為5 μmol/L時，與對照組相比，熒光假單胞菌菌落數對數值減小1.84（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；隨著姜黃素濃度的增大，對熒光假單胞菌的PDI效果也隨之增強，當姜黃素濃度增加至75 μmol/L時，PDI效果達到最大，熒光假單胞菌菌落數對數值減小7.46（lg（CFU/mL）），滅活效果顯著強于其他組（P＜0.05）。姜黃素濃度為100 μmol/L時，對熒光假單胞菌的滅活效果不再增強，反而略有降低。

光照時間對PDI作用的影響

光照時間對熒光假單胞菌的PDI作用的影響如圖2所示。光照時間對熒光假單胞菌的PDI效果影響顯著，且呈現出隨光照時間延長先增強后減弱的趨勢。光照時間為20 min時，光動力殺菌效果達到最佳，選擇此條件進行后續實驗。與對照組相比，熒光假單胞菌菌落數對數值顯著減小6.40（lg（CFU/mL））（P＜0.05）。隨著光照時間的繼續延長，滅活效果反而減弱。

EDTA質量分數對PDI作用的影響

如圖3所示，EDTA對PDI的協同增效作用隨著其質量分數的增加呈先增強后減弱的趨勢。與對照組相比，當EDTA質量分數分別為0.1%、0.3%時，熒光假單胞菌菌落數對數值分別顯著降低了0.37、0.91（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；當EDTA質量分數增加至0.5%時，PDI協同促進效果最佳，熒光假單胞菌菌落數對數值顯著下降2.29（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；之后隨著EDTA質量分數的增加，其對PDI的協同效果反而逐漸減弱。

2、熒光假單胞菌生物膜的形成

圖4A～H分別為培養0、6、12、24、36、48、60、72 h后的熒光假單胞菌生物膜經結晶紫染色后的顯微圖片。圖4A無生物膜形成；圖4B、C的熒光假單胞菌稀疏分散，隨著培養時間的延長，菌體分布逐漸密集；圖4D的菌體數量明顯增多，菌體之間相互聚集；培養至60 h時，生物膜已經相對成熟，菌體之間更加密集（圖4G）；培養至72 h，熒光假單胞菌已經將蓋玻片完全覆蓋（圖4H）。

3、姜黃素介導的PDI對熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

對玻璃表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

姜黃素介導的PDI對玻璃表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果如表1所示。與空白組相比，光照條件下的姜黃素對熒光假單胞菌生物膜有顯著的破壞效果，菌落數對數值減小3.44（lg（CFU/mL）），加入EDTA后菌落數對數值減小4.57（lg（CFU/mL）），EDTA顯著提高了姜黃素的PDI作用（P＜0.05）。而無光照條件下的姜黃素對熒光假單胞菌生物膜的破壞作用有限，加入EDTA溶液后，滅活效果仍未得到改善。

對ABS板表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

由表2可知，姜黃素介導的PDI處理使其表面生物膜菌落數對數值下降4.42（lg（CFU/mL））；加入0.5% EDTA溶液后，菌落數對數值減小約6.60（lg（CFU/mL）），顯著提高了PDI效果（P＜0.05）。

4、PDI處理對新鮮豬肉的保鮮效果

熒光假單胞菌菌落數變化

不同豬肉4 ℃貯藏期間熒光假單胞菌的菌落數變化如圖5所示。貯藏0 d，與空白組相比，PDI處理豬肉表面熒光假單胞菌菌落數對數值減小了2.68（lg（CFU/g）），添加0.5% EDTA后，豬肉表面菌落數對數值減少3.23（lg（CFU/g）），表明PDI處理對新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌具有良好的滅活效果，而且EDTA能夠進一步提高其滅活效果。隨貯藏時間的延長，空白組豬肉表面的熒光假單胞菌快速生長，第3天時菌落數增長至7.90（lg（CFU/g）），而經PDI處理后的豬肉中熒光假單胞菌生長緩慢，第3天時PDI組的菌落數為5.00（lg（CFU/g）），顯著低于空白組（P＜0.05）；第10天時，空白組豬肉的熒光假單胞菌菌落數增長至8.99（lg（CFU/g）），而PDI組的菌落數為6.57（lg（CFU/g）），PDI＋EDTA組豬肉中熒光假單胞菌菌落數僅為5.94（lg（CFU/g）），顯著低于其他處理組（P＜0.05），表明PDI＋EDTA處理對新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌具有更好的抑菌效果。

質量損失率的變化

如圖6所示，在經過PDI處理后的當天，PDI組質量損失率最大，為2.14%；PDI＋EDTA組的質量損失率為1.79%。殼聚糖對照組及PDI組豬肉的質量損失率隨著貯藏時間的延長逐漸增大。豬肉經一定時間的光照處理后，表面溫度出現短暫、輕微的升高，這可能與豬肉質量損失有一定的關系。這也提示本實驗所用PDI處理設備需要增加冷卻裝置或提高光照強度以縮短光照時間。

色澤的變化

光照處理前后不同濃度的姜黃素溶液顏色如圖7A所示，光照20 min后，不同濃度的姜黃素溶液顏色均較光照前明顯變淺。為了進一步探明不同濃度姜黃素在豬肉上的使用效果，采用色差儀分別測定不同濃度姜黃素PDI處理后豬肉的色澤，并計算ΔE，結果如圖7B所示，新鮮豬肉的ΔE與姜黃素濃度總體呈現正相關關系。75 μmol/L的姜黃素溶液處理豬肉經光照后，第0天ΔE為3.03，顯著高于對照組（P＜0.05），但感官上可以接受。姜黃素濃度越大，ΔE越大。同時，隨著新鮮豬肉貯藏時間的延長，ΔE沒有呈現出明顯的變化規律，且同一濃度姜黃素處理的豬肉無顯著性差異（P＞0.05）。

pH值的變化

如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，各處理組豬肉的pH值逐漸升高，這主要是由于豬肉中細菌數量的增加其蛋白質和氨基酸發生降解，形成氨和胺類等堿性物質。在10 d的貯藏期內，PDI＋EDTA組豬肉pH值從5.87增加至6.17，與空白組及其他處理組相比，pH值增加相對平緩。由此可以看出，PDI＋EDTA作用能夠減緩豬肉在貯藏過程中的腐敗速率，更好地保持豬肉的新鮮程度。

結 論

本研究結合光敏劑姜黃素濃度、光照時間、協同劑EDTA，優化了對熒光假單胞菌PDI作用的最佳條件，明確了姜黃素協同EDTA的PDI作用對熒光假單胞菌生物膜的去除效果。應用實驗室自行研制的光動力殺菌裝置，嘗試分析EDTA聯合姜黃素的PDI作用對新鮮豬肉的保鮮效果。結果表明，姜黃素聯合EDTA的PDI作用對優勢嗜冷性腐敗菌-熒光假單胞菌及其生物膜均具有良好的滅活效果，并能顯著抑制新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌，改善豬肉感官品質，延長豬肉的保鮮期。